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    食品有害微生物快速檢驗方法|食品有害微生物控制技術

    來源:六七范文網 時間:2019-05-22 04:47:29 點擊:

      摘要 食品有害微生物檢驗在食品衛生檢驗中具有十分重要的作用。綜述食品有害微生物快速檢驗方法,涉及分子生物學技術、抗原抗體免疫檢測技術、載體儀器技術、代謝學技術、生物傳感器、色譜技術等方面內容,介紹各種檢測方法的原理、應用、結果判斷等,可為食品有害微生物的準確檢測提供參考和指導。
      關鍵詞 食品;有害微生物;快速檢驗方法
      中圖分類號 TS207.4 文獻標識碼 A 文章編號 1007-5739(2012)14-0284-02目前,食品有害微生物的污染對食品的影響而造成的疾病仍是主要的問題。常規檢測準確靈敏,但缺點是操作時間長,檢測步驟較繁瑣。因此,針對食品中的有害微生物檢測,建立快速、準確的檢測體系對確保食品安全極其重要,也是當前各國學者研究的重點[1]。隨著現代科技的不斷發展,以及人們對食品安全、公共衛生的重視,將會逐步完善和建立各種簡便、快捷的新型微生物快速檢測技術。
      1 分子生物學技術
     ?。?)PCR技術。即聚合酶鏈反應技術,采用體外酶促(耐熱DNA聚合酶)反復作用,通過變性—延伸—復性的循環操作,迅速將DNA模板擴增數百萬倍,再用凝膠電泳和紫外核酸檢測儀觀察擴增結果來識別細菌[2]。當前,主要有3種技術應用到微生物檢測中[3]:一是嵌套多聚酶鏈反應技術,產生擴增的DNA片段上含有第2輪PCR引物的結合位點,在此片段上應用第1套引物,片段中第1輪反應產物被等分轉入第2輪PCR引物,PCR受微生物的干擾由擴增靶DNA來消除;二是隨機擴增多態DNA分析多聚酶鏈反應技術(RAPD—PCR),即使用任意引物,得到一群長短不一的DNA片段混合物;三是采用一套由一個特異引物和一個普通引物所組成的引物,或使用一套特異性的引物,結果僅產生一種產物,進而進行檢測。
     ?。?)核酸探針法[3]。即以補體核酸分子作為探針,將標記后的探針加入已變性的被檢DNA(單鏈)樣品中,在一定條件下可與樣品中的互補的DNA區段形成雜交雙鏈,從而可以鑒定樣品中DNA。以前在實驗室常采用放射性同位素標記探針。而隨著科技的發展,基于核糖體RNA(tRNA)發育過程中儲存的核酸成分,現在多采用比色計進行標記和檢測。新型檢測方法使用富含rRNA的標靶序列,不僅保持較高的靈敏度,而且實現無輻射檢測[4]。
     ?。?)基因芯片技術[5]。采用一塊面積很小的玻片、硅片或尼龍膜作為載體,在預定位置固定肽核苷酸、寡核苷酸或cDNA,集成的微點陣列即構成基因芯片[6]。檢測原理:靶基因選定為致病菌的共有基因(16 SrDNA、23SrDNA及ERIC),采用一對通用引物擴增,為區分細菌,利用芯片上的探針檢測細菌在共有基因上的獨特堿基,從而實現檢測。
      2 抗原抗體免疫檢測技術
      抗原抗體反應是指抗原與相應抗體所發生的特異性結合反應。體外反應可出現凝集反應、沉淀反應、補體參與的反應及中和反應等反應類型。具體應用技術如下。
     ?。?)酶聯免疫分析法(ELISA)[7]。ELISA基礎是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標記,其原理是把抗原或抗體在不損壞其免疫活性的條件下預先結合到某種固相載體表面;測定時將受檢樣品(含待測抗體或抗原)和酶標抗原或抗體按一定程序與結合在固相載體上的抗原或抗體起反應形成抗原或抗體復合物;反應終止時,固相載體上酶標抗原或抗體被結合量(免疫復合物)與標本中待檢抗體或抗原的量成一定比例,經洗滌去除反應液中其他物質,加入酶反應底物后,底物被固相載體上的酶催化變為有色產物,通過定性或定量分析有色產物量即可確定樣品中待測物質含量[8]。
     ?。?)斑點酶聯免疫吸附試驗。將抗原或抗體吸附在纖維素膜的表面,通過相應抗體或抗原和酶標記物形成復合物,加入底物后結合物上的酶將底物水解氧化成帶色物質,呈現出肉眼可見的顏色斑點。
     ?。?)免疫電泳技術。該技術將凝膠擴散置于直流電場中,讓電流加速抗原和抗體的擴散,并規定其運動方向,從而使沉淀反應時間大大縮短,敏感度顯著提高。包括火箭電泳試驗和對流免疫電泳試驗。
     ?。?)單克隆抗體檢測技術。利用細胞培養和細胞融合技術制備具有抗原特異性單一的抗體,可辨認抗原物質結構的微細差異,并發生特異性結合,精確地測定抗原物質含量[9]。
     ?。?)免疫磁球法。該技術將特異性抗體偶聯在磁性顆粒表面,與樣品中被檢微生物發生特異性結合;該磁球在外加磁場作用下向磁極聚集,從而快速分離出目的微生物。
     ?。?)免疫膠體金技術。以微孔濾膜為載體包被已知抗原或抗體,加人待檢標本后,經濾膜的毛細管作用或滲濾作用使標本中的抗原或抗體與膜上包被的抗體或抗原結合,再用膠體金結合物標記而達到檢測目的[10]。
     ?。?)免疫轉印技術。將凝膠電泳與固相免疫測定結合,將經電泳分區的蛋白質精確近似定量地轉移到固相載體上,并保持其原有的生物活性,再經熒光,免疫、酶免疫、放射免疫技術等進行測定,實質上分3步驟即蛋白質組分分離、各組分轉印及免疫檢測。
      3 載體儀器技術
     ?。?)快速測試片法[11]。培養基的載體采用紙膜、紙片,在其上面附著特定的顯色物質和某種培養基,根據載體上微生物的生長特性來測定。
     ?。?)濾膜法。將濾膜放入濾器過濾樣品,濾膜保留微生物,樣品中生長抑制劑可用無菌水沖洗濾器除去,然后將濾膜放在培養基上培養,在濾膜表面上培養出的菌落可計數。
     ?。?)旋轉平板和激光菌落掃描法。在瓊脂培養基表面倒一薄層樣品,在平板旋轉作用下液體從中心向邊緣流動,分布均勻。采用激光菌落計數器計算菌落的數量,利用儀器底部的光檢測儀掃描平板,激光束通過菌落時可降低光強度,從而檢測菌落的存在[8-9]。
     ?。?)流式細胞術(FCM)。FCM通常以激光作為發光源照射于樣品流上,被熒光染色的細胞產生散射光和激發熒光。熒光信號強度表征微生物細胞核內物質的濃度或細胞膜表面抗原的強度,光散射信號表征細胞的體積。  ?。?)固相細胞計數法(SPC)。該方法不需要生長相,在單細胞水平快速檢測細菌。先將樣品過濾,采用熒光標記濾膜上的存留物,由激光掃描設備自動計數。每個熒光點可直觀地由通過計算機驅動的流動臺連接到ChemScan上的落射熒光顯微鏡來檢測。在短時間內,可根據熒光標記獲得有關微生物特性及生理狀態的信息[12]。
     ?。?)VITEK-AM S。主要用于藥敏試驗和微生物鑒定試驗中。包括讀數、編碼、解碼、打印過程,有效結合計算機技術和微生物數碼鑒定技術,實現全程操作的自動化。
      4 代謝學技術
     ?。?)電阻抗技術。微生物在培養過程中會使培養基中的大分子電惰性物質代謝為具有電活性的小分子物質,由此增加培養基的導電性改變其阻抗。檢測電阻抗變化,可實現對不同微生物生長、繁殖特性的判定。
     ?。?)微熱量計技術。微生物生長為放熱過程,獲得產熱量—時間變化曲線,即可鑒別微生物。產熱可采用微熱量計測定,通過計算機信號的數字模擬,在界面記錄器上繪制產熱量—時間的熱曲線,再進行對比分析[13]。
     ?。?)放射量技術。該技術在碳水化合物或鹽類等底物分子中引入微量14C,微生物生長代謝過程釋放14 CO2,采用自動化放射儀Bactec,通過測定14 CO2量來判斷微生物數量。
     ?。?)接觸酶測定技術。由于接觸酶與H2O2反應釋放氧氣的特性,含有酶的紙盤會浮到試管表面。接觸酶含量高,紙盤上浮的時間短。大多數嗜冷性細菌型微生物的接觸酶呈陽性,而食品中的嗜冷性菌群可利用接觸酶反應來估計。
      5 生物傳感器
      生物體中包含多種活性物質如酶、抗體抗原,對其處理制成生物功能敏感元件,并與待測物質接觸,其產生的光熱信號或符合產品能夠通過信號轉換器來傳播信息,并放大輸出得到相應檢測結果,這就形成生物傳感器,包括免疫傳感器和基因傳感器。
      6 色譜技術
      經過水解甲醇分解、提取以及硅烷化甲基化等衍生化后,微生物細胞被分解成多個化學組分,采用液相色譜或氣象色譜分析微生物組分。在色譜圖中,少數的峰具有特征性,大多數的峰具有共性,可利用該特性鑒定微生物成分。
      7 其他技術
     ?。?)微列陣。微陣列是對事物的有序排列,其樣品點直徑小于200 μm,必須用特定的自動儀和顯像設備來顯像檢測。其中,DNA微陣列用途最廣泛,即用熒光標記為靶DNA,將載物玻璃片和膜上作為探針DNA的寡聚核苷酸及cDNA,掃描二者的雜交顯像,測定雜交微陣列中各樣品點的熒光高度,統計分析即得。
     ?。?)電子鼻子。檢測過程包括樣品處理、檢測和數據分析。一般食品樣品中含有不穩定的化合物,可與大量氣體傳感器產生反應,鑒定樣品化學組成即達到檢測目的。該技術具有操作方便、反應快的優點。
     ?。?)納米裝置。以納米粒子作為標記物,主要有熒光分析法、分光光度法和電化學分析法,在檢測裝置中將納米粒子與待測DNA偶聯測定。
     ?。?)ATP生物發光檢測法。在Mg2+存在下,螢火蟲熒光素酶以D-熒光素酶、ATP、O2為底物,將化學能轉化為光,其發光強度(I)與ATP濃度(CATP)符合一定的函數關系;當CATP遠小于Km時,I正比于樣品中的CATP。因此??赏ㄟ^測定發光體系的I來定量ATP濃度。
      8 參考文獻
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