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    外源基因在大腸桿菌中的誘導表達_木聚糖酶基因xynA在大腸桿菌中的高效表達

    來源:六七范文網 時間:2019-05-22 04:45:28 點擊:

      摘要 參照Genebank中疏棉狀嗜熱絲孢菌木聚糖酶A基因序列,以引物拼接方式,人工合成采用大腸桿菌優勢密碼子的基因xynA,插入pET-20b載體,獲得重組表達載體pET-20b-xynA。重組菌在16 ℃下誘導效果最好,10 h酶活達到42.05 U/mL,重組酶占全細胞蛋白的47%,粗酶在65 ℃和pH 5~8條件下很穩定。
      關鍵詞 木聚糖酶A基因;優勢密碼子;高效表達
      中圖分類號 Q78 文獻標識碼 A 文章編號 1007-5739(2011)12-0326-02
      β-1,4-D-木聚糖水解酶目前已經得到廣泛應用,耐熱、耐堿、熱穩定性好是其理想的特征,其水解產物低聚木糖以木二糖、木三糖為主[1-2]。低聚木糖具有顯著的雙歧桿菌增殖能力、不被消化等特性,但是自然界木聚糖降解酶系均存在木糖苷酶活性,影響了低聚木糖的產率。因此,構建產木聚糖酶的工程菌,已成為生物技術在食品工業的研究熱點。
      疏棉狀嗜熱絲孢菌是一種嗜熱真菌,產生的木聚糖酶在高溫和堿性條件穩定,降解產物中單糖含量很少[3]。該酶在原產菌中的表達需要木糖等誘導劑,但是嗜熱真菌培養比較困難,產酶周期長且酶系復雜。在原核系統中重組表達的產量很低,不能滿足應用要求[4]。該試驗嘗試采用大腸桿菌中的優勢密碼子,以引物拼接的方式合成基因,利用pET-20b載體在16 ℃下實現木聚糖酶在大腸桿菌中高效表達。
      1 材料和方法
      1.1 引物設計
      根據Genebank中疏棉狀嗜熱絲孢菌DSM 5826木聚糖酶A基因序列,在不改變氨基酸的前提下使用優勢密碼子,設計14條引物合成基因xynA,相鄰引物末端有互補區域以利于引物退火延伸(圖1)。
      1.2 引物片斷的拼接
      參照美國Promega公司的Altered SitesⅡ Protocol的方法,將14條引物混合磷酸化,產物75 ℃變性后,以大約1 ℃/min的速度緩慢降溫至45 ℃退火,再迅速降至22 ℃終止退火。加入DNA聚合酶和連接酶,37 ℃下延伸和補平。
      1.3 目的基因xynA的克隆
      設計上下游引物C1和C2,EcoRⅠ和Hind Ⅲ酶切位點分別為黑體所示:C1:CCCGAATTCATG CAGACCACCCCGA AC;C2:CCCAAGCTTTTAGCCAACGTCAGCAACAG[2]。以拼接產物為模板,Ex-taq DNA聚合酶巢式PCR擴增基因。反應條件:95 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s,57 ℃ 30 s,72 ℃ 60 s,循環29次;72 ℃ 10 min。產物回收后雙酶切插入質粒pUC19位點。
      1.4 重組表達質粒的構建和表達
      以測序正確的質粒pUC19-xynA為模板,設計合成引物C3和C4(黑體所示分別為NdeⅠ和XhoⅠ酶切位點):C3:CCCCATATGCAGACCACCCCGAAC;C4:CCCCTCGAGTTA GCCAACGTCAGCA ACAG,以Probest DNA聚合酶進行擴增,條件同1.3。產物回收后雙酶切插入質粒pET-20b相應位點。將重組質粒pET-20b-xynA轉入大腸桿菌JM109,接種于含100 μg/mL氨芐青霉素的LB培養液中,37 ℃振蕩過夜后轉接培養至OD600達0.6,加入IPTG至終濃度0.8 mol/L,分別在37、16 ℃下繼續培養12 h,每隔2 h收集菌液。
      1.5 酶活測定
      木聚糖酶活性的測定是以燕麥木聚糖為底物,利用對羥基苯甲酸酰肼(PAHBAH)與水解反應產生的還原糖的顯色反應進行比色[2,5]。
      2 結果與分析
      2.1 基因的合成及重組表達質粒的構建
      巢氏PCR法擴增出588 bp的片斷(圖2a),與設計基因序列一致。以pUC19-xynA為模板PCR獲得目的基因,構建重組表達質粒pET-20b-xynA,酶切結果與預期一致(圖2b)。
      2.2 木聚糖酶在大腸桿菌中的重組表達
      重組表達質粒轉化大腸桿菌JM109,37 ℃誘導2 h酶活達到最大值3.99 U/mL,其后逐漸下降,菌液濃度在誘導4 h時達到最大值;16 ℃誘導10 h酶活性達到最大值42.05 U/mL,菌液濃度緩慢增大,12 h達到最大值(圖3)。
      收集誘導10 h時菌液破碎細胞,SDS-PAGE結果表明,重組菌產生約23 kDa的特異條帶,與預期蛋白相對分子量一致[2]。16 ℃誘導產生的重組酶在全細胞總蛋白中占比47%,比例比37 ℃誘導時高,但多數重組酶以不溶性的形式存在,復性處理可以重新檢測到木聚糖酶活性(圖4)。
      2.3 重組木聚糖酶的酶活性質
      粗酶在60 ℃穩定性很高,溫育6 h后仍有80%的相對活性,70 ℃下失活很快。在60 ℃下溫育30 min,粗酶在pH值5.0~8.0的范圍內均比較穩定,相對活性均保持在80%以上,在pH值4.5以下的環境很不穩定[2]。水解木聚糖的產物主要為木二糖、木三糖、木四糖以及其他聚合度的低聚糖[2],沒有木糖,說明酶的水解方式沒有變化。
      3 討論
      外源基因在大腸桿菌中表達水平受多因素影響,如啟動子、載體、基因的高級結構及密碼子偏好等。產自疏棉狀嗜熱絲孢菌的木聚糖酶A的成熟蛋白共有196個氨基酸,其中31個氨基酸是由大腸桿菌中稀有密碼子編碼,前10個氨基酸中4個由稀有密碼子編碼,此外,R58是由最稀有的密碼子AGA編碼,AGA已經被證明會阻礙蛋白正常表達[2,6];L105和R117分別由CUA和CGA編碼,是大腸桿菌中第二稀有密碼子對[2]。為避免密碼子偏好影響木聚糖酶重組表達,該研究通過基因合成改造木聚糖酶A基因序列。
      該研究實現了重組酶的高水平表達,但多數以包涵體的形式表達,僅有部分有活性。已有多種方法解決蛋白過量表達時出現的包涵體問題,包括共表達分子伴侶、降低表達溫度、分泌到胞外培養基或周質空間等[7]。研究發現,16 ℃下酶蛋白表達水平和酶活性均有較大提高,可能是較低溫度下酶穩定性更好,仍有多數酶蛋白以包涵體形式存在。研究認為包涵體形成可能是該木聚糖酶自身氨基酸序列的緣故,折疊時不能迅速被大腸桿菌識別,導致翻譯的多肽鏈集聚形成包涵體。有研究報道,氨基酸突變能增加重組蛋白的可溶性[8],后續研究可在這方面進行嘗試。   4 參考文獻
      [1] 劉超綱,勇強,余世袁.低(無)纖維素酶活的木聚糖酶制備途徑與潛在應用[J].纖維素科學與應用,2001,9(2):1-7.
      [2] 殷爾康.疏棉狀嗜熱絲孢菌木聚糖酶A在大腸桿菌中的高效表達[D].南京:南京師范大學,2007.
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